CaLB1与ESCRT蛋白ALIX通过相分离机制调节自噬体发育
自噬与真核细胞中的不同过程有关，因此其调节至关重要。
近日，来自德国康斯坦茨大学生物系的Erika Isono团队在Nature Communications发表研究成果“Arabidopsis CaLB1 undergoes phase separation with the ESCRT protein ALIX and modulates autophagosome maturation”，该研究在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中提出了CaLB1在增强ALIX相分离中的关键作用，促进ESCRT-III募集到吞噬细胞闭合位点，从而确保自噬体的有效成熟。
图1 CaLB1与ALIX相互作用。
首先想确定拟南芥ALIX是否是自噬所必需的，并研究了ATG8和BRCA1基因1（NBR1）的邻居在野生型和ALIX无效突变体中的积累（图1）。两者都与自噬货物一起运输到液泡并在液泡中降解。我们研究了 ATG8 和 NBR1 的水平，发现 ATG8 和 NBR1 都在 alix-2 和 alix-4 中积累，如在自噬缺陷的 atg7-2 中观察到的那样（图 1a），表明 ALIX 是适当的自噬周转所必需的。接下来，为了研究ALIX在自噬中的分子功能，作者使用ALIX作为针对拟南芥ORF文库的诱饵进行了酵母双杂交筛选18并鉴定出 Ca2+依赖性脂质结合 （CaLB） 蛋白，我们将其命名为 CaLB1 （AT4G34150），作为 ALIX 的相互作用物。CaLB1 具有氨基 （N） 末端 II 型 C2 结构域和羧基 （C） 末端富含脯氨酸结构域 （PRD） （图 1）。最接近的同系物 AT1G63220 和 AT3G55470 分别与 CaLB24 共享 3.23% 和 6.1% 的氨基酸同一性，并且缺乏 PRD（图 1b）。1a，b）。CaLB1 的序列同源物可以在其他植物物种中找到，但在 opisthokonts 中找不到（图 1c）。为了确定负责 ALIX 和 CaLB1 之间相互作用的区域，作者使用拟南芥 ALIX 和 CaLB1 的片段进行了 YTH 分析（图 1b–e）。在体外下拉试验中，CaLB6-1xHis 与缺乏 BRO1 结构域的 MBP 标记的 ALIX（ΔBRO1） 相互作用，但与缺乏 PRD 的 MBP-ALIX （BRO1） 相互作用（图 1f）。同样，GST标记的ALIX与全长CaLB2相互作用，但不与缺乏PRD的CaLB1（C1）相互作用（图1g），表明 CaLB<> 和 ALIX 通过它们的 PRD 相互作用。为了研究 CaLB1 和 ALIX 在植物中的共定位，作者生成了表达 CaLB1pro：CaLB1-mRFP 和 ALIXpro：GFP-ALIX 的植物。共聚焦显微镜显示，CaLB1-mRFP定位于细胞质和胞质病灶，为ALIX14.35.3% 的 CaLB1-mRFP 病灶与 GFP-ALIX 共定位（图 1h），表明 CaLB 和 ALIX 可以在同一个细胞区室中发挥作用。
图2 CaLB1和ALIX结合阴离子磷脂PI（3）P。
CaLB1的C2结构域具有三个可能的钙结合区域（CBRs）（图2a）。C2结构域最初在蛋白激酶C中进行了表征，是一种在真核生物中广泛保守的球形膜结合结构域。大多数含有C2结构域的蛋白质以Ca2+依赖的方式结合膜脂，并在信号转导、膜运输和膜融合等方面具有多样化的功能。微量热流动法（MST）分析表明，CaLB1（C2）能够结合Ca2+而不能结合Mg2+（见图2b）。由于全长CaLB1在MST分析所需的浓度下发生沉淀，因此结合研究仅能进行C2结构域。当一个预测的Ca2+结合环中的一个天冬氨酸残基发生突变时，得到的CaLB1[C2(D32A)]变体的Ca2+亲和力减小（图2b）。由于C2结构域是已知的膜结合结构域，作者想知道CaLB1是否也能结合膜脂，并使用重组CaLB1-6xHis在存在10µM Ca2+或5mMEGTA时进行了脂质蛋白覆盖实验。在测试的磷脂类物质中，CaLB1以Ca2+依赖的方式优先结合磷酸肌醇-3-磷酸[PI(3)P]（图2c）。CaLB1可以以Ca2+浓度依赖的方式与融入到膜双层中的磷酰肌醇酸相互作用22。为了了解CaLB1与膜的结合是否依赖于PI(3)P，我们在存在20µM Ca2+的条件下，在含有PI(3)P或磷酸肌醇-4-磷酸[PI(4)P]的固体支持的脂质双层（SSLB）上进行了衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析23,24。当使用Ca2+结合环突变体CaLB1(D32A)代替野生型CaLB1，或者使用含有PI(4)P的膜时，对膜的亲和力减小（图2d），表明CaLB1更倾向于与含有PI(3)P的膜结合，而Ca2+对此相互作用至关重要。为了测试拟南芥ALIX与磷脂类物质的结合，作者准备了重组的拟南芥ALIX及其酵母和人类拟物ScBro1和HsALIX，并进行了脂质覆盖实验（图2e）。HsALIX在实验中没有与任何磷脂相结合，而拟南芥ALIX和Bro1与PI(3)P相互作用。这些结果表明，CaLB1和拟南芥ALIX都可以与含有PI(3)P的细胞膜结合。
图3 CaLB1与ATG8相互作用。
作者为了确定CaLB1在自噬体上的可能功能，测试了CaLB1是否与ATG8相互作用。拟南芥有九个ATG8同源体。通过CaLB1-GST和His标记的ATG8a、ATG8f和ATG8i之间的体外拉力实验，代表I类（ATG8a和ATG8f）和II类（ATG8i）ATG8的CaLB1-GST可以直接与His标记的ATG8相互作用（图3a）。由于ATG8是一种类泛素蛋白质，我们还测试了CaLB1是否与泛素相互作用。荧光标记的CaLB1(C2)与泛素和ATG8i的MST分析表明，CaLB1与ATG8相互作用，但不与泛素相互作用（图3b）。接下来作者在CaLB1中搜索已知的ATG8相互作用线性基序，[W/F/Y]XX[V/L/I]，或ATG8相互作用基序（AIM）。使用iLIR网络数据库，坐着鉴别出四个可能的AIMs，并研究了AIM序列的替代是否对ATG8-CaLB1交互作用产生影响。虽然GAD-CaLB1(Y172A)和GAD-CaLB1(Y205A)仍与GBD-ATG8i相互作用，但GAD-CaLB1(Y34A)和GAD-CaLB1(F64A)不结合GBD-ATG8i（图3c），表明这些氨基酸残基对CaLB1与ATG8的相互作用是重要的。
图4 CaLB1的CRISPR突变体对盐敏感。
由于已有报道表明盐胁迫能够快速诱导自噬，作者分析了盐处理后CaLB1、ALIX和ATG8s的表达情况。定量实时（qRT）-PCR分析显示，盐处理30分钟后CaLB1的表达显著增加，而ALIX和ATG8s的表达没有明显变化（图4a）。在盐处理后，表达CaLB1-GFP、GFP-ALIX或者GFP-ATG8a的幼苗显示出GFP-融合蛋白水平的增加（图4b），这表明除了CaLB1的转录调控外，在NaCl处理过程中可能存在着ALIX和ATG8a的后转录调控机制。接下来，作者产生了CaLB1的CRISPR突变体，以分析其在自噬中的功能。分别选出了两个独立的calb1突变体，并命名为calb1-1和calb1-2。如果CaLB1在适当的盐应答中是必要的，calb1突变株会对NaCl处理显示出改变的应答。因此，作者将野生型、calb1-1和calb1-2幼苗以及atg10-1突变株一同暴露在含100 mM NaCl的培养基中。与野生型相比，类似于atg10-1幼苗，calb1-1和calb1-2显示出主根长度明显减少（图4c和d），表明CaLB1对幼苗的盐应答是必要的。CaLB1pro:CaLB1-GFP构建恢复了calb1-1的盐敏感性（图4c–e），表明CaLB1-GFP融合蛋白是功能性的，而NaCl敏感表型是由CaLB1位点上的突变导致的。
图5 CaLB1和ALIX定位于盐诱导的自噬体上。
本研究探讨了NaCl对CaLB1和ALIX的调控是否伴随着它们在细胞内的定位变化。首先，在表达CaLB1pro: CaLB1-GFP、ALIXpro: GFP-ALIX或UBQ10pro: GFP-ATG8a的幼苗中，分析了CaLB1和ALIX焦点以及GFP-ATG8a标记的自噬体的数量。在150 mM NaCl处理后，GFP-ATG8a标记的自噬体数量增加，同时CaLB1-GFP和GFP-ALIX焦点的数量也显著增加(图a-d)，且CaLB1-mRFP与GFP-ALIX的共定位效率提高到54.0%(图e)。
本研究通过生成表达CaLB1pro: CaLB1-GFP与自噬体标记UBQ10pro:mRFP-ATG8i的转基因拟南芥系，探讨了CaLB1和ALIX阳性焦点是否代表自噬体。在150 mM NaCl处理2小时后，CaLB1-GFP定位在mRFP-ATG8i标记的自噬膜的特定区域，并偶尔定位在质膜上(图f)。研究还生成了表达不同ATG8亚群标记的拟南芥线，发现CaLB1-GFP也定位在mRFP-ATG8a或mRFP-ATG8e标记的自噬体膜上，表明CaLB1与ATG8的共定位不依赖于特定的ATG8亚群(图f和k)。在自噬体中，75%的CaLB1阳性自噬体有一个CaLB1焦点，22.2%和2.8%的自噬体分别有两个和三个CaLB1-GFP焦点(图g)。69.4%的自噬体中，CaLB1-GFP稳定地与自噬膜结合，但也可以观察到随时间与自噬体的结合和解离。8.3%和11.1%的自噬体中，CaLB1-GFP焦点出现在或从自噬体消失。
为了在超微结构水平上分析CaLB1的定位，研究进行了免疫金标记，发现抗GFP抗体标记自噬膜，证实CaLB1与自噬体结合(图h)。通过多步分级分离，免疫印迹分析显示CaLB1存在于富含自噬体的膜部分，与ATG8和NBR1共定位(图i)。
为了探究CaLB1在自噬体上的定位是否依赖于CaLB1与ATG8之间的相互作用，生成了表达CaLB1pro: CaLB1(F64A)-GFP和UBQ10pro: mRFP-ATG8i的转基因拟南芥株系。在这些株系中，野生型CaLB1与自噬体共定位，而CaLB1(F64A)-GFP（一种不与ATG8相互作用的变体）与mRFP-ATG8i的共定位相比野生型CaLB1有所减少(图j和k)。这一结果表明，CaLB1与ATG8之间的相互作用对于CaLB1被招募到自噬体上是非常重要的。可能展示了这些共定位实验的结果，显示了野生型CaLB1和CaLB1(F64A)-GFP与自噬体的不同共定位程度。
作者通过分析共表达ALIXpro: GFP-ALIX和UBQ10pro: mRFP-ATG8i的拟南芥幼苗，来确定ALIX是否也定位在自噬体上。与CaLB1类似，GFP-ALIX在盐诱导的自噬膜上定位在一个明确的区域（图5l）。在分析的自噬体中，69.6%的GFP-ALIX作为单个点状结构位于mRFP标记的自噬体上，而17%和5.6%的自噬体分别有两个和三个焦点。与CaLB1-GFP不同，9.0%的自噬体中，GFP-ALIX显示出沿着mRFP-ATG8标记的自噬体膜的环状分布（图5m），这表明CaLB1和ALIX可能通过不同的机制定位到自噬体上。
图6 1,6-己二醇处理时，CaLB1的焦点（foci）消失。
研究探讨了CaLB1和ALIX蛋白在植物细胞中形成相分离的生物分子凝聚体（condensates）的能力，并研究了这些凝聚体对1,6-己二醇处理的响应。作者观察到CaLB1-GFP（绿色荧光蛋白标记的CaLB1）形成的圆形焦点类似于典型的相分离生物分子凝聚体。为了测试这些焦点是否可以通过干扰凝聚体中分子间疏水相互作用的酒精来溶解，他们使用了1,6-己二醇（一种用于溶解分子凝聚体的有机化合物）处理5天大的表达CaLB1pro:CaLB1-GFP的幼苗。5%的1,6-己二醇处理显著减少了CaLB1-GFP焦点的数量，而疏水性较低的1,2,6-己三醇则效果较弱（图6a，b）。进一步的实验表明，1,6-己二醇处理后，CaLB1和ALIX的焦点数量显著减少，而标记自噬体的mRFP-ATG8i的数量没有变化（图6c，e）。这表明CaLB1和ALIX在植物细胞中定位于相分离的凝聚体上。研究还发现，移除1,6-己二醇后15分钟，CaLB1-GFP焦点重新出现，表明CaLB1能够在细胞质和凝聚体之间动态移动（图6d，f）。为了了解CaLB1的存在是否影响拟南芥ALIX凝聚体的形成，研究者分析了拟南芥根细胞培养来源的原生质体中GFP-ALIX焦点的数量。使用CRISPR技术敲除CaLB1后，GFP-ALIX焦点的数量减少，表明CaLB1的存在增强了ALIX在活细胞中的焦点形成（图6g-j）。
这些结果表明，CaLB1和ALIX在植物细胞中参与了相分离的凝聚体的形成，并且CaLB1可能对ALIX凝聚体的形成有促进作用。
图7 CaLB1和ALIX能够聚集在一起形成凝聚体（condensates）。
旨在研究CaLB1和ALIX两种蛋白质如何通过相分离形成凝聚体，并探讨了CaLB1的C-末端无序区域（IDR）在这一过程中的作用。蛋白质序列分析：使用IUPred2和AlphaFold模型分析CaLB1和ALIX的氨基酸序列，发现CaLB1和ALIX的C-末端存在无序区域（IDR）（图7a），这些区域被认为是相分离和凝聚体形成的主要驱动力。制备了重组的CaLB1-6xHis、CaLB1(C2)-6xHis（CaLB1的C-末端IDR缺失的版本）和ALIX。CaLB1和CaLB1(C2)被NHS-Red标记，ALIX被Alexa Fluor 488标记。将标记的蛋白质在体外混合并孵育30分钟，观察凝聚体的形成。结果显示，全长的CaLB1和ALIX能够形成圆形结构，而CaLB1(C2)则不能，表明CaLB1的C-末端IDR对于凝聚体的形成是必需的（图7b）。随着CaLB1浓度的增加，ALIX凝聚体的数量增加，而CaLB1凝聚体的数量不受ALIX浓度的影响（图7c）。这表明CaLB1的存在促进了ALIX凝聚体的形成。当CaLB1的IDR缺失时，ALIX凝聚体的数量减少，表明CaLB1和ALIX之间的相互作用通过它们的蛋白质相互作用域（PRDs）触发凝聚体的形成。ALIX和CaLB1凝聚体的大小随着蛋白质浓度的增加而增大，且CaLB1的IDR对于这种效应是必需的（图7d）。
通过FRAP分析研究了凝聚体中标记蛋白质的流动性。结果显示，CaLB1和ALIX的荧光信号都能恢复，但ALIX的动态性低于CaLB1，且CaLB1的存在不影响ALIX在凝聚体中的流动性（图7e-h）。综上所述，这些结果表明CaLB1和ALIX能够在体外和体内通过相分离形成凝聚体，并且CaLB1的IDR对于这两种蛋白质高效地组装成凝聚体是必要的。这一发现对于理解细胞内凝聚体的形成和功能具有重要意义。
图8 CaLB1调节自噬体成熟。
旨在研究CaLB1蛋白在盐胁迫诱导的植物细胞自噬过程中的作用。使用50 µM的单丹磺酰尸胺（MDC）标记自噬体，观察到自噬体在根表皮细胞的液泡中可见。然而，CaLB1-GFP信号在这些结构上不明显（图8a）。MDC染色与GFP-ATG8a信号重叠，且在自噬缺陷的atg10-1细胞中未观察到MDC信号，表明MDC信号依赖于功能性自噬（图f）。分析了在盐处理下，CaLB1-GFP和GFP-ALIX的蛋白水平，以及在有无E-64d（液泡蛋白酶抑制剂）的情况下的变化。结果显示，NBR1在E-64d处理后积累，但CaLB1-GFP没有类似的积累（图8b,c），表明CaLB1不被有效靶向到液泡。对于GFP-ALIX，没有观察到与NBR1有显著差异（图8c）。比较了野生型和calb1-1突变体在150 mM NaCl处理2小时后的自噬体数量。calb1-1突变体在盐处理后自噬体数量增加更多，表明calb1-1突变体可能在盐胁迫诱导的自噬体向液泡运输方面存在缺陷（图8d,e）。使用100 mM NaCl处理野生型、calb1-1和CaLB1pro: CaLB1-GFP表达的calb1-1，然后用100 µM E-64d处理，并用MDC可视化自噬体。结果显示，野生型和CaLB1-GFP表达的calb1-1中的自噬体大小相似，而calb1-1中的MDC染色自噬体面积显著减少，表明CaLB1的功能对于盐胁迫诱导的自噬体正确运输是必需的（图8f，g）。通过qRT-PCR分析了野生型和calb1-1在150 mM NaCl处理90分钟后所有9个ATG8基因的表达。结果显示，除了ATG8g在calb1-1中减少外，其他ATG8基因的表达在calb1-1和野生型之间没有显著差异，表明自噬体积累不是由于自噬诱导增加。为了研究CaLB1在自噬体成熟中的作用，分析了野生型和calb1-1中的ESCRT-III定位。为此，生成了一个表达GFP或mRFP标记的VPS2.1的构建体，并测试了它是否能补充vps2.1 null突变体。结果显示，携带VPS2.1-3xFLAG-GFP的纯合vps2.1突变体幼苗可以恢复，并且与野生型无异，表明生成的VPS2.1pro: VPS2.1-3xFLAG-GFP构建体是功能性的。
综上所述，这些实验结果表明CaLB1在盐胁迫诱导的自噬过程中对于自噬体的成熟和运输是必需的，并且可能通过影响ESCRT-III复合物的功能来发挥作用。
图9 CaLB1调节自噬体成熟。
旨在验证CaLB1蛋白在自噬体成熟过程中的作用。生成了在野生型和calb1-1突变体中共同表达UBQ10pro: GFP-ATG8a和VPS2.1pro: VPS2.1-3xFLAG-mRFP的植物线。在150 mM NaCl处理2小时后，观察到VPS2.1-mRFP信号在ATG8a标记的自噬体上（图9a）。然而，这些事件的数量有限，可能是因为其瞬态性质。在野生型中，3.9%的自噬体（n = 2351）和在calb1-1中2.3%的自噬体（n = 1660）显示了ESCRT信号，但两种基因型之间没有显著差异。作者使用透射电子显微镜分析了野生型和calb1-1幼苗根部的自噬体封闭情况。在calb1-1幼苗中，62.9%的自噬体是开放的，37.1%是封闭的（n = 70自噬体）。这与野生型中的情况相反，其中42.6%的自噬体是开放的，57.4%是封闭的（n = 68自噬体）（图9b）。尽管在野生型和calb1-1之间观察到了显著差异，但作者意识到通过二维超薄切片分析三维自噬体可能会导致偏差结果。从野生型和calb1-1中提取的自噬体富集部分的总蛋白在150 mM NaCl处理2小时后，用Proteinase K处理。如果自噬体封闭受损，应该会导致未保护的GFP-ATG8a在蛋白酶处理下的降解增加，而GFP-ATG8a在成熟自噬体内部则保持保护。尽管野生型和calb1-1中的GFP-ATG8a水平相当，但在calb1-1中，膜结合的GFP-ATG8a的回收效率低于野生型。在calb1-1的自噬体富集部分中，Proteinase K处理后观察到GFP-ATG8a的降解增加（图9c，d），表明calb1-1中未封闭的自噬体更多，暗示自噬体成熟在calb1-1中受损。为了监测calb1-1中的自噬流，检查了野生型和calb1-1幼苗中GFP-ATG8a和自由GFP的比例。定量结果显示，在所有测试条件下，calb1-1的GFP-ATG8a周转率显著低于野生型（图9e，f）。综上所述，这些实验结果表明CaLB1在自噬体成熟过程中起着重要作用，calb1-1突变体中的自噬体封闭受损，导致自噬体成熟和自噬流受阻。这些发现对于理解自噬过程中的分子机制具有重要意义。
图10 CaLB1在自噬中的功能模型。
总结所有实验数据，表明CaLB1在盐胁迫下被诱导表达，并与ALIX相互作用并定位于自噬体上，同时与ALIX发生相分离形成分子凝聚体。研究结果还显示，CaLB1能够触发ALIX高效组装成分子凝聚体。ALIX在凝聚体中的积累可能促进或增加ALIX与ESCRT（内体分拣转运复合体）组分之间的相互作用，从而导致ESCRT在自噬体封闭位点的聚集。这些发现揭示了CaLB1在盐胁迫诱导的自噬过程中的关键作用，特别是它如何通过与ALIX的相互作用影响自噬体的成熟和封闭。CaLB1和ALIX之间的相互作用可能通过促进ESCRT复合物的聚集，从而在自噬体的封闭过程中发挥作用。这一机制的阐明对于理解植物如何响应环境胁迫并调节自噬途径具有重要意义。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-49485-6
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