利用CRISPR/Cas9对LIGULELESS1等位基因进行编辑精细调节甘蔗的叶片倾角

甘蔗(Saccharum spp. hybrid)是世界上生物量产量最大的作物，对全球生物燃料和食糖工业都有重大贡献。作为C4禾本科植物，甘蔗的高光合、氮利用和水利用效率使其成为通过生物技术方法帮助减缓气候变化的主要候选者。优化冠层结构以改善光捕获对提高生物量产量具有很大的潜力。而甘蔗是一种基因组极其复杂的高多倍体植物，通过传统育种对其进行遗传改良具有挑战性。利用设计核酸酶进行基因编辑在加速包括甘蔗在内的多倍体作物的遗传改良方面具有巨大的潜力。基因编辑通过将一个或多个目标修饰直接引入作物基因组而绕过减数分裂，这允许同时编辑多个基因拷贝，并通过避免杂交过程从而提高结果的可预测性。

2024年5月22日，国际著名期刊Plant Biotechnology journal在线发表了题为“The extent of multiallelic, co-editing of LIGULELESS1 in highly polyploid sugarcane tunes leaf inclination angle and enables selection of the ideotype for biomass yield”的研究文章。Brant等人以CRISPR/Cas9技术为手段，在甘蔗中实现了叶夹角表型相关基因LG1及其多等位基因的共突变，这项工作证明了甘蔗中LG1位点的高效多等位基因编辑，并观察到的叶片角可调表型使多倍体甘蔗植物冠层结构的理想型选择成为可能。

LIGULELESS1 (LG1)参与了禾本科植物叶片叶舌和叶耳的发育，该研究想通过突变LG1以实现甘蔗的株型转变，即叶夹角减小，株型直立。为了设计CRISPR靶向诱变，首先必须分析目标基因序列。近年来，甘蔗单倍体参考基因组的组装为该方法提供了一个起点。在这里，该研究报道了CRISPR/Cas9介导的高多倍体甘蔗中LG1基因多达40个拷贝/等位基因的共突变(2n=100-120,x=10-12)。下一代测序显示，78个转基因系中有16个LG1 reads的共同编辑频率为7.4%-100%。LG1突变导致叶片角表型可调，随着共编辑频率的增加，叶片角表型变得更加直立。在随机温室试验中，选择3个lg1功能损失频率分别为~12%、~53%和~95%的品系，在重复多行大田种植。共同编辑的LG1突变在营养后代中稳定保持，在田间试验品系L26和L35中，共同编辑的程度保持不变。下一代测序证实了潜在脱靶基因的缺失。叶片倾角与透光量和分蘖数相对应。L35系在lg1 NGS（下一代测序）序列中约12%的部分丧失功能，叶片倾角降低56%，分蘖数增加31%，节间数增加25%，干生物量产量增加18%。

综上，高度多倍体甘蔗LG1的可扩展的共编辑可以对叶片倾角进行微调，从而实现生物量产量理想型的选择。

图1 LG1基因座、sgRNA位置和基因编辑载体元件图谱

图4 利用CRISPR/Cas9编辑获得的lg1突变系多行重复田间试验的表型、生物量和光相关测量