一、PCR反应抑制因素
1、体系内部因素
1）引物：PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA的互补程度。PCR的首要任务就是引物设计，引物设计遵循有一定的原则。
①引物长度要适宜。一般引物的长度为15-30个碱基，过长不利于引物与模板结合且引物易形成二级结构，过短则特异性差。
②引物GC含量要适宜。引物的GC含量一般为40-60%，而且上下游引物的GC含量不能相差太大，GC含量过高或过低都不利于和模板的退火。引物3'端的碱基一般避免A/T，因为A/T之间为2个氢键（G/C为3个），在错误引发位点的引发效率相对比较高，同时3'端应防止连续3个C或G，连续的GC不利于引物3'端和模板的结合。
③引物自身及引物之间不应存在互补序列。碱基要随机分布，引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补，否则引物自身会折叠成发夹结构或二聚体，从而影响引物与模板的退火。④引物5'端可以修饰，3'端不可修饰。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。引物5'端不决定扩增的特异性可以被修饰，引物5'端修饰包括：加酶切位点，标记荧光素/生物素，引入点突变、插入突变、缺失突变序列，引入启动子序列等。 ⑤引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间。上下游引物Tm值要保持接近，一般Tm值不超过5℃。
⑥产物不能形成二级结构。选择不易形成二级结构的基因组区域设计引物。
⑦引物3'端不要终止于密码子（UAA、UAG、UGA），因终止密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
2）酶及其浓度：酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
3）dNTP的质量和浓度：dNTP溶液呈酸性，一般配置成体系需将其调节至7.0-7.5，正常情况下4种dNTP的浓度应该相等，如果其中某一种过高就会引起错配，浓度过低又会影响PCR产物的产量。
4）核酸模板：模板的量、纯度、完整度都对PCR反应有影响。5）Mg2+浓度：主要影响PCR扩增的特异性和产量，一般要对应dNTP的浓度。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。6）温度与时间的设置：PCR原理三步骤涉及变性-退火-延伸三个温度点，也就是变性温度与时间、退火温度与时间、延伸温度与时间。模板GC含量高要延长变性时间；引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使引物易于与DNA模板结合；产物长度长需要对应延长延伸时间。7）循环次数：循环次数决定PCR扩增程度，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。环循环次数越多，非特异性产物的量就越多，碱基错配率也越高。
2、体系外部因素
1）SDS（十二烷基硫酸钠）：阴离子去污剂，可以破坏酶蛋白质的非共价键（氢键和疏水键），并结合到蛋白质的疏水部位，从而使酶蛋白质变性，并丧失天然构象和功能。0.01%即可完全抑制PCR反应，0.005%可显著降低产量。
2）苯酚：有机溶剂，能使酶蛋白变性。0.5%即可完全抑制PCR反应，0.2%可显著降低产量。
3）乙醇：有机溶剂，大于1%的浓度可抑制PCR反应。
4）异丙醇：有机溶剂，对PCR反应的抑制作用比乙醇稍强。
5）乙酸钠（NaAc）：大于5mM时抑制PCR反应。引起反应体系PH降低，与DNA形成钠盐复合物而聚合沉淀。
6）氯化钠：大于25mM时抑制PCR反应。
7）EDTA：金属离子螯合剂，能够螯合体系中的Mg2+，抑制聚合酶活性。0.5mM可使PCR产物减少，1mM完全没有PCR产物 |